备及双重响应体系一的制载药二硫究其性纳米能研化钼

癌症常规治疗策略主要有手术、双重化疗和放疗，响应系的性但是硫化疗效局限性、药物毒副作用及耐药性等仍是钼纳米载治疗过程中面临的巨大挑战，目前癌症仍然是药体研究导致人类死亡的主要原因之一。近年来，制备纳米技术在提高癌症药物疗效方面显示出前所未有的双重优势。其中，响应系的性二硫化钼作为一种新型的硫化二维材料备受人们的关注。二硫化钼不仅具有较大的钼纳米载比表面积，而且其组成元素Mo是药体研究细胞中几种酶的必需微量元素，S是制备一种常见的生物元素。因此，双重MoS2在生物医药领域的响应系的性应用具有巨大的潜力。阿霉素（DOX）具有抗瘤谱广，硫化疗效强的特点。但是，由于DOX在使用时会引起严重的毒副作用，长期使用还会导致耐药性。

因此，可在特定区域实现定点释放药物的智能纳米复合物逐渐引起研究者们的兴趣，如开发可刺激响应的药物载体。目前，环境刺激响应的纳米载药体系在肿瘤病理环境刺激，如温度、酶、酸度和氧化还原条件，响应纳米载药体系可在病灶部位有效释放其加载的治疗药物。肿瘤细胞中谷胱甘肽的浓度在1～10mmol/L之间，比细胞外循环和体液中谷胱甘肽的浓度（2～10mol/L）高出500～1000倍。利用这一区别，设计二硫键连接DOX的纳米载药体系逐渐被应用于生物医药的研究，该共价载药方法与通过静电吸附DOX的载药方法相比，前者可减少药物在运输过程中的泄露。

为了提高DOX在肿瘤部位的聚集实现高效杀死肿瘤细胞的目的。
RGD是一种靶向分子，可特异性识别琢淄茁3整合素受体，因此，增加靶向分子为纳米载药体系提供了指引的作用，使纳米载药体系与肿瘤细胞特异性结合从而提高治疗效果。本文设计了一种靶向MoS2纳米载药体系，以MoS2纳米片为基底，硫辛酸聚乙二醇羧酸（LA-PEG-COOH）为接枝连接靶向分子RGD，之后连接上SPDP，得到MoS2-PEG-RGDSPDP（MPRS）纳米载体。最终通过共价键合DOX得到MPRS-DOX纳米载药体系，并研究其载药量及释药性能。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试剂

钼酸铵·四水、硫脲、硫辛酸-聚乙二醇-羧酸（LA-PEG-COOH）（相对分子质量为5000）、精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（RGD）、3-（2-吡啶二硫代）丙酸N-琥珀酰亚胺酯（SPDP）、盐酸阿霉素、谷胱甘肽（还原型），购自阿拉丁试剂上海有限公司。EDTA，购自索莱宝生物科技有限公司。

1.1.2 实验仪器

十万分之一电子分析天平，美国梅特勒-多利多仪器（上海）有限公司；超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；超纯水机，成都越纯科技有限公司；透射电子显微镜（TEM），日本电子株式会社；X-射线光电子能谱，赛默飞世尔科技有限公司；ZetasizerNanoZS纳米粒度电位仪，英国马尔文仪器有限公司；紫外-可见分光光度计，日本岛津仪器有限公司；荧光分光光度计，美国安捷伦公司；高速离心机，上海湘仪离心机仪器有限公司；磁力搅拌器，艾卡（广州）仪器设备有限公司；冷冻干燥机,北京博医康实验仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 MoS2的制备MoS2纳米片的制备参考文献中的制备方法，将2.336g钼酸铵·四水和5.057g硫脲溶解在70mL的去离子水中，并用超声助溶形成均相溶液。将得到的均相溶液置于100mL内衬为聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中，在200℃烘箱中反应10h。反应结束后，冷却至室温，在12500r/min下离心20min，弃去上清液，重复清洗4次，最后用去离子水分散，超声处理8h，4500r/min离心10min后，取上清液，除去底部大尺寸的二硫化钼，将得到的上清液用透析袋（8000~14000Da）除杂，即可得到二硫化钼纳米片分散液。

1.2.2 MoS2-PEG（简称MP）的制备参考文献[31]的方法：称取50mgLA-PEG-COOH粉末加入0.25mg/mL20mL的MoS2分散液中，超声处理30min，搅拌24h后，透析杂质，得到的MP分散液。

1.2.3 MoS2-PEG-RGD（简称MPR）的制备参考文献的制备方法，称取96mgEDC加入17.5mL1.60mg/mL的MP分散液，避光搅拌20min，加入80.5mgNHS，避光搅拌1h，之后加入400滋L12.5mg/mLRGD溶液，避光搅拌24h，停止搅拌后以12500r/min离心10min，重复清洗3次，透析除杂，得到MPR分散液。将部分分散液冷冻干燥得到固体的MPR储存备用，其余的MPR密封放置于4℃冰箱保存备用。

1.2.4 MoS2-PEG-RGD-SPDP（简称MPRS）的制备参考文献的制备方法，称取2.20mg3-（2-吡啶二硫代）丙酸N-琥珀酰亚胺酯（SPDP）加入到35mL0.43mg/mLMPR分散液中，缓慢搅拌4h后，透析除杂，得到MPRS分散液。将部分分散液冷冻干燥得到固体的MPRS储存备用，其余的MPRS分散液密封放置于4℃冰箱保存备用。

1.2.5 MoS2-PEG-RGD-SPDP-DOX（简称MPRS-DOX）的制备称取9.00mgDOX和2.16mg亚氨基噻吩于10mL离心管中，加入1mL去离子水溶解DOX，并用0.01mol/LPBS（pH=7.4磷酸缓冲对，含1mmol/LEDTA）稀释至9mL，避光静置反应4h。将以上制备得到的9mLDOX-SH溶液与18.0mL0.5mg/mLMPRS分散液混合，然后将混合分散液避光搅拌24h，之后以12500r/min离心45min，沉淀物用10mmol/LPBS（pH=7.4,磷酸缓冲对溶液）分散，即可得到MPRS-DOX分散液。将部分分散液冷冻干燥得到固体的MPRS-DOX储存备用，剩余的MPRS-DOX分散液密封放置于4℃冰箱保存备用。

1.2.6 MPRS的载药研究称取10.00mg盐酸阿霉素置于10.00mL容量瓶中，用超纯水稀释至刻度，超声处理至阿霉素完全溶解，得到1mg/mL阿霉素储备液，将其依次配制成浓度为5、10、15、20、25、30、35、40滋g/mL的标准溶液，分别使用紫外-可见分光光度计测定各标准溶液在480nm波长处的吸光度值，以浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制DOX标准曲线。

为了验证DOX是通过共价连接MPRS，采用紫外-可见分光光度计检测MPRS、DOX、MPRS-DOX在800～200nm波长范围内的紫外-可见光谱。取适量MPRS分散液、DOX溶液、MPRS-DOX分散液稀释至一定的浓度，然后利用紫外-可见分光光度计检测。将MPRS与不同浓度（0.1,0.2,0.4,0.8,1mg/mL）的巯基化阿霉素溶液混合，在37℃避光振荡24h，以12500r/min离心45min，收集上清液，通过紫外分光光度计测试其载药能力。根据公式（1）和（2）推算出MPRS-DOX的载药量以及载药效率。

1.2.7 MPRS-DOX的体外释药将质量比为1:1的MPRS分散液和DOX混合，搅拌24h，离心收集沉淀，再用去离子水分散MPRS-DOX浓度至1mg/mL。采用荧光分光光度计检测MPRS-DOX对GSH响应释放DOX的情况。取200LMPRS-DOX分散液和200L不同浓度（0，2滋mol/L，10mmol/L）GSH加入到2mLEP管中，并用10mmol/LPBS（pH=7.4和pH=5.5磷酸缓冲对）稀释至1mL，避光恒温（37℃）振荡4h，然后以12500r/min离心20min，收集上清液和沉淀物，在Ex=488nm波长下扫描上清液中DOX的荧光光谱，扫描波长范围为500~700nm。

1.2.8 材料表征使用TEM观察制备的MoS2和MPRS的形貌。使用X-射线光电子能谱仪对MoS2、MP、MPR、MPRS进行测试分析。使用纳米粒度电位仪测试MoS2、MP、MPR、MPRS和MPRS-DOX的粒度分布和电位。采用紫外-可见分光光度计对MPRS的载药情况进行测试。采用荧光分光光度计测试MPRS-DOX释放DOX的情况。

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